**內(nèi)**檢查法（2005年一部）
附錄ⅩⅢD**內(nèi)**檢查法
本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的**內(nèi)**，以判斷供試品中**內(nèi)**的限量是否符合規(guī)定的一種方法。
**內(nèi)**檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進(jìn)行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。
內(nèi)**的量用內(nèi)**單位(EU)表示。
**內(nèi)**國家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸埃希菌提取精制而成。用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定**內(nèi)**工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價。
**內(nèi)**工作標(biāo)準(zhǔn)品系以**內(nèi)**國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價，用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。
凝膠法**內(nèi)**檢查用水系指內(nèi)**含量小于0.015EU/ml的**注射用水。光度測定法用的**內(nèi)**檢查用水，其內(nèi)**的含量應(yīng)小于0.005EU/ml。
試驗所用器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)**，常用的方法是250℃干烤至少60分鐘，也可采用其他確證不干擾**內(nèi)**的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)**并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物的污染。
供試品溶液的制備 某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.0~8.0的范圍內(nèi)。對于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的PH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)PH值。酸或堿溶液須用**內(nèi)**檢查用水在已去除內(nèi)**的容器中配制。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)**和干擾因子。
內(nèi)**限值的確定 藥品、生物制品的**內(nèi)**限值（L）一般按以下公式確定：
L=K/M
式中 L為供試品的**內(nèi)**限值，以EU/ml、EU/mg 或EU/U（活性單位）表示；
K為人每公斤體重每小時*大可接受的內(nèi)**劑量，以EU/(kg.h)表示，注射劑
K=5EU/(kg.h)，放射**品注射劑K=2.5EU/(kg.h)，鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kg.h)；
M為人用每公斤體重每小時的*大供試品劑量，以ml/(kg.h)、mg/(kg.h)或U/(kg.h)
表示，人均體重按60kg計算，注射時間若不足1小時，按1小時計算。
按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。
確定*大有效稀釋倍數(shù)（MVD） *大有效稀釋倍數(shù)是指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的*大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)**限值的檢測。用以下公式來確定MVD：
MVD=CL/λ
式中 L為供試品的**內(nèi)**限值；
C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/ml表示時，則C等于1.0ml/ml，當(dāng)L以EU/mg或EU/U表示時，C的單位需為mg/ml或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD取1，可計算供試品的*小有效稀釋濃度C=λ/L；
λ為在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度（EU/ml），或是在 光度測定法中所使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線上*低的內(nèi)**濃度。
方法1 凝膠法
凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)**產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測或半定量內(nèi)**的方法。
鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗 在本檢查法規(guī)定的條件下，使鱟試劑產(chǎn)生凝集的內(nèi)**的*低濃度即為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度，用EU/ml表示。當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能影響檢驗結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。
根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值(λ),將**內(nèi)**國家標(biāo)準(zhǔn)品或**內(nèi)**工作標(biāo)準(zhǔn)品用**內(nèi)**檢查用水溶解，在旋渦混合器上混合15分鐘，然后制成2.0λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內(nèi)**標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10mm *75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.l ml不同濃度的內(nèi)**標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個內(nèi)**濃度平行做4管；另外2管加入0.1 ml **內(nèi)**檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。
將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。
當(dāng)*大濃度2λ管均為陽性，*低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。
ΣX
λc＝lg<-1>───
4
式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)**濃度中*后一個呈陽性結(jié)果的濃度。
當(dāng)λc在0.5λ～2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)時，方可用于**內(nèi)**檢查，并以標(biāo)示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。
干擾試驗。按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗出內(nèi)**且不超過*大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。
只有當(dāng)溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度復(fù)核范圍內(nèi)時，試驗方為有效。按下列計算系列溶液C和B的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Es和Et）。
Es=1/lg（ΣXs/4)
Et=1/lg（ΣXt/4)
式中 Es、Et分別為系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。
當(dāng)Es在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es）時，認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下對試驗有干擾，應(yīng)將供試品溶液進(jìn)行不超過MVD的進(jìn)一步稀釋，再重復(fù)干擾試驗。
表1 凝膠法干擾試驗溶液的制備
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編號 內(nèi)**濃度/配制 稀釋用液 稀釋 所含內(nèi)毒 平行
內(nèi)**的溶液 倍數(shù) 素的濃度 管數(shù)
───────────────────────────────────────────────────
A 無/供試品溶液 2
────────────────────────────────────────────────────
B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2λ 4
2 1λ 4
4 0.5λ 4
8 0.25λ 4
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C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2λ 4
2 1λ 4
4 0.5λ 4
8 0.25λ 4
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D 無/檢查用水 2
─────────────────────────────────────────────────────
注：A為供試品溶液；B為干擾試驗系列；C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列；D為陰性對照。
可通過對供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)**失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)**再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾實驗。
當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)**檢查試驗前，或無內(nèi)**檢查項的品種建立內(nèi)**檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗。
當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗。
檢查法
（1）凝膠限量試驗
按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數(shù)為MVD并且已經(jīng)排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。
表2 凝膠限量試驗溶液的制備
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編號 內(nèi)**濃度/配制內(nèi)**的溶液 平行管數(shù)
──────────────────────────────────────────────
A 無/供試品溶液 2
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B 2λ/供試品溶液 2
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C 2λ/檢查用水 2
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D 無/檢查用水 2
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注：A為供試品溶液；B為供試品陽性對照；C為陽性對照；D為陰性對照。
結(jié)果判斷 保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。
若溶液A的兩個平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；若溶液A的兩個平行管均為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；否則判供試品不符合規(guī)定。
（2）凝膠半定量試驗
本方法系通過確定反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)**的含量。按表3制備溶液A、B、C、和D。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗項下操作。
結(jié)果判斷 若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.5λ~2λ之間，試驗有效。
系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以λ，為每個系列的反應(yīng)終點濃度，所有平行管反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)**濃度［按公式CE=lg<-1>( ΣX/2)］。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋數(shù)，則計算原始溶液內(nèi)**濃度時要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。
如試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應(yīng)記為內(nèi)**濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進(jìn)行半定量試驗的初始稀釋倍數(shù)）。如果供試品溶液的所有平行管均為陽性，應(yīng)記為內(nèi)**的濃度大于或等于*大的稀釋倍數(shù)乘以λ。
表3 凝膠半定量試驗溶液的制備
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編號 內(nèi)**濃度/配制 稀釋用液 稀釋 所含內(nèi)毒 平行
內(nèi)**的溶液 倍數(shù) 素的濃度 管數(shù)
───────────────────────────────────────────────────
A 無/供試品溶液 檢查用水 1 2
2 2
4 2
8 2
────────────────────────────────────────────────────
B 2λ/供試品溶液 供試品溶液 1 2λ 2
────────────────────────────────────────────────────
C 2λ/檢查用水 檢查用水 1 2λ 2
2 1λ 2
4 0.5λ 2
8 0.25λ 2
────────────────────────────────────────────────────
D 無/檢查用水 2
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注：A為不超過MVD并且通過干擾試驗的供試品溶液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始用檢查用水稀釋至1倍、2倍、4倍和8倍，*后的稀釋倍數(shù)不得超過MVD。
B為2 λ 濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)**的溶液A（供試品陽性對照）。
C為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對照系列。
D為陰性對照。
若內(nèi)**濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。若內(nèi)**濃度大于或等于規(guī)定的限值，判供試品不符合規(guī)定。
方法2 光度測定法
光度測定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法。
濁度法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)**反應(yīng)過程中的濁度變化而測定內(nèi)**含量的方法。根據(jù)檢測原理，可分為終點濁度法和動態(tài)濁度法。終點濁度法是依據(jù)反應(yīng)混合物中的內(nèi)**濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在著量化關(guān)系來測定內(nèi)**含量的方法。動態(tài)濁度法是檢測反應(yīng)混合物的濁度到達(dá)某一項先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或是檢測濁度增加速度的方法。
顯色基質(zhì)法系利用檢測鱟試劑與內(nèi)**反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)**含量的方法。根據(jù)檢測原理，分為終點顯色法和動態(tài)顯色法。終點顯色法是依據(jù)反應(yīng)混合物中內(nèi)**濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團(tuán)的量之間存在的量化關(guān)系來測定內(nèi)**含量的方法。動態(tài)顯色法是檢測反應(yīng)混合物的色度達(dá)到某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反應(yīng)時間，或檢測色度增長速度的方法。
光度測定試驗需在特定的儀器中進(jìn)行，溫度一般為37℃±1℃。
供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明進(jìn)行。
為保證濁度和顯色試驗的有效性，應(yīng)預(yù)先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗以及供試品的干擾試驗。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗 當(dāng)使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生了任何可能會影響檢驗結(jié)果的改變時，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗。
用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)**配成溶液，制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10），*低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰行對照。當(dāng)陰性對照的反應(yīng)時間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線*低濃度的反應(yīng)時間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。
根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）的**值應(yīng)大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。
干擾試驗 選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中點或一個靠近中點的內(nèi)**濃度（設(shè)為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內(nèi)**濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。
表4 光度測定法干擾試驗溶液的制備
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編號 內(nèi)**濃度 配制內(nèi)**的溶液 平行管數(shù)
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A 無 供試品溶液 不少于2個
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B 標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點（或附 供試品溶液 不少于2個
近點）的濃度（設(shè)為λ m）
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C 至少3個濃度（*低一點 檢查用水 每一濃度
設(shè)定為λ） 不少于2個
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D 無 檢查用水 不少于2個
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注：A為稀釋倍數(shù)不超過MVD的供試品溶液。
B為加入了標(biāo)準(zhǔn)曲線中點或靠近中點的一個已知濃度內(nèi)**的，且與溶液A有相同稀釋倍數(shù)的供試品溶液。
C為如“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗”項下描述的，用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)**溶液。
D為陰性對照。
按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)**的供試品溶液的內(nèi)**含量Ct和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。
R=（Cs - Ct）/ λ m *100%
當(dāng)內(nèi)**的回收率在50%~200%之間，則認(rèn)為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。
當(dāng)內(nèi)**的回收率不在指定的范圍內(nèi)，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素。并重復(fù)干擾試驗來驗證處理的有效性。
當(dāng)鱟試劑、供試品的來源、配方、生產(chǎn)工藝改變或?qū)嶒灜h(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進(jìn)行干擾試驗。
檢查法
按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進(jìn)行檢測。
使用系列溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算溶液A的每一個平行管的內(nèi)**濃度。
試驗必須符合以下三個條件方為有效：
（1）系列溶液C的結(jié)果要符合“標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗”中的要求；
（2）用溶液B中的內(nèi)**濃度減去溶液A中的內(nèi)**濃度后，計算出的內(nèi)**的回收率要在50%~200%的范圍內(nèi)；
（3）溶液D的反應(yīng)時間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線*低濃度的反應(yīng)時間。
結(jié)果判斷 若供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)**濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)**限值，判供試品符合規(guī)定。若大于或等于規(guī)定的內(nèi)**限值，判供試品不符合規(guī)定。
注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應(yīng)容器 ，如微孔板中的孔。
