**法定義（2005年版一部）
附錄ⅩⅥ **法
**法系指用適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)手段將物品中活的微生物殺滅或除去的方法。本法適用于制劑、原料、輔料及醫(yī)療器械等物品的**。
無菌物品是指品中不含任何活的微生物。對(duì)于任何一批**產(chǎn)品來說，**無菌既無法保證，也無法用試驗(yàn)來證實(shí)。實(shí)際生產(chǎn)過程中，**是指將物品中污染的微生物殘存概率下降至一定水平，以無菌保證水平SAL(sterilityassurance level)表示。*終**的產(chǎn)品微生物存活概率不得高10{-6}。已**產(chǎn)品達(dá)到的無菌保證水平可通過驗(yàn)證確定。
**產(chǎn)品達(dá)到的無菌保證不能依賴于*終產(chǎn)品的無菌檢驗(yàn)，而是取決于生產(chǎn)過程中采用合格的**工藝、嚴(yán)格的GMP管理和良好的無菌保證體系。**工藝的確定應(yīng)綜合考慮被**物品的性質(zhì)、**方法的有效性和經(jīng)濟(jì)性、**后物品的完整性等因素。
**程序的驗(yàn)證是無菌保證的必要條件。**程序經(jīng)驗(yàn)證后，方可交付正式使用。驗(yàn)證內(nèi)容包括：
（1）撰寫驗(yàn)證方案及制定評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。
（2）確認(rèn)**設(shè)備技術(shù)資料齊全、安裝正確，并能處于正常運(yùn)行（安裝確認(rèn)）。
（3）確認(rèn)關(guān)鍵控制設(shè)備和儀表能在規(guī)定的參數(shù)范圍內(nèi)正常運(yùn)行（運(yùn)行確認(rèn)）。
（4）采用被**物品或模擬物品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，確認(rèn)**效果符合規(guī)定（性能確認(rèn)）。
（5）匯總并完善各種文件和記錄，撰寫驗(yàn)證報(bào)告。
日常生產(chǎn)中，應(yīng)對(duì)**程序的運(yùn)行情況進(jìn)行監(jiān)控，確認(rèn)關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、壓力、時(shí)間、濕度、**氣體濃度及吸收的輻照劑量等）均在驗(yàn)證確定的范圍內(nèi)。**程序應(yīng)定期進(jìn)行再驗(yàn)證。當(dāng)**設(shè)備或程序發(fā)生變更（包括**物品裝載方式和數(shù)量的改變）時(shí)，應(yīng)進(jìn)行再驗(yàn)證。
產(chǎn)品的無菌保證與**前產(chǎn)品被污染的程度及污染的特性相關(guān)。因此，應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控被**品**前的微生物污染水平及污染菌的耐受性，并在生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)采取各種措施降低污染，確保微生物污染控制在規(guī)定的限度內(nèi)。
**冷卻階段，應(yīng)采取措施防止已**物品被再次污染。任何情況下，都應(yīng)要求容器及其密封系統(tǒng)確保產(chǎn)品的有效期內(nèi)符合無菌要求。
**方法
常用的**方法有濕熱**法、干熱**法、輻射**法、氣體**法和過濾**法。可根據(jù)被**物品的特性采用一種或多種方法組合**。只要產(chǎn)品允許，應(yīng)盡可能選用*終**法**。若產(chǎn)品不適**用*終**法，可選用過濾**法或無菌生產(chǎn)工藝達(dá)到無菌保證要求，只要可能，應(yīng)對(duì)非*終**的產(chǎn)品作補(bǔ)充性**處理（如流通蒸汽**）。
一、濕熱**法
本法系指將物品置于**柜內(nèi)利用高壓飽和蒸汽、過熱水噴淋等手段使微生物菌體中的蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生變性而殺滅微生物的方法。該法**能力強(qiáng)，為熱力**中*有效、應(yīng)用*廣泛的**方法。藥品、容器、培養(yǎng)基、無菌衣、膠塞以及其他遇高溫和潮濕不發(fā)生變化或損壞的物品，均可采用本法**。流通蒸汽不能完全殺滅**孢子，一般可作為不耐熱無菌產(chǎn)品的輔助**手段。
濕熱**條件通常采用121℃*15min、121℃*30min、或116℃*40min的程序，也可采用其他溫度和時(shí)間參數(shù)，但必須保證物品**后的SAL《10-6。對(duì)熱穩(wěn)定的物品，可采用過度殺滅法，其SAL應(yīng)《10-12。熱穩(wěn)定性較差產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)**時(shí)間F0［指**溫度為121℃，生物指示菌的耐熱參數(shù)D值為1分，**溫度系數(shù)Z值為10.0℃時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)**時(shí)間（121℃下計(jì)算的微生物等效滅活率）］一般不低于8min。如產(chǎn)品的熱穩(wěn)定性很差時(shí)，可允許濕熱**的F0低于8，此情況下，應(yīng)在生產(chǎn)全過程中，對(duì)產(chǎn)品中污染的微生物嚴(yán)加監(jiān)控，并采取各種措施降低微生物污染水平，確保被**產(chǎn)品達(dá)到無菌保證要求。
采用濕熱**時(shí)，被**物品有適當(dāng)?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證**的有效性和均一性。
濕熱**法應(yīng)確認(rèn)**柜在不同裝載時(shí)可能存在的冷點(diǎn)。當(dāng)用生物指示劑進(jìn)一步確認(rèn)**效果時(shí)，應(yīng)將其置于冷點(diǎn)處。本法生物指示劑為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（sporesof Bacillus stearothermophilus）。
二、干熱**法
本法系指將物品置于干熱**柜、隧道**器等設(shè)備中，利用干熱空氣達(dá)到殺滅微生物或消除熱原物質(zhì)的方法。適用于耐高溫但不宜用濕熱**法**的物品**，如玻璃器具、金屬材質(zhì)容器、纖維制品、固體試藥、液狀石蠟等均可采用本法**。
干熱**條件一般為160~170℃*120min以上、170~180℃*60min以上或250℃*45min以上，也可采用其他溫度和時(shí)間參數(shù)。應(yīng)保證物品**后的SAL《10-6。干熱過度殺滅后物品的SAL應(yīng)《10-12，此時(shí)物品一般無需進(jìn)行**前污染微生物的測(cè)定。250℃*45min的干熱**也可除去無菌產(chǎn)品包裝容器及有關(guān)生產(chǎn)灌裝用具中的熱原物質(zhì)。
采用干熱**時(shí)，被**物品應(yīng)有適當(dāng)?shù)难b載方式，不能排列過密，以保證**的有效性和均一性。
干熱**法應(yīng)確認(rèn)**柜中的溫度分布符合設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)及確定*冷點(diǎn)位置等。常用的生物指示劑為枯草芽孢桿菌孢子（Spores of Bacillus subtilis）。**內(nèi)**滅活驗(yàn)證試驗(yàn)是證明除熱原過程有效性的試驗(yàn)。一般將小于1000單位的**內(nèi)**加入待去熱原的物品中，證明該去熱原工藝能使內(nèi)**至少下降3個(gè)對(duì)數(shù)單位。**內(nèi)**滅活驗(yàn)證試驗(yàn)所用的**內(nèi)**一般為大腸埃希菌內(nèi)**(Escherichiacoli endoxin )。
三、輻射**法
本法系指**物品置于適宜放射源輻射的γ射線或適宜的電子加速器發(fā)生的電子束中進(jìn)行電離輻射而達(dá)到殺滅微生物的方法。本法*常用的60Co-γ射線輻射**。醫(yī)療器械、容器、生產(chǎn)輔助用品、不受輻射破壞的原料藥及成品等均可用本法**。
采用輻射**法**后的產(chǎn)品其SAL應(yīng)《10-6。γ射線輻射**所控制的參數(shù)主要是輻射劑量（指**物品的吸收劑量）。該劑量的制定應(yīng)考慮**物品的適應(yīng)性及可能污染的微生物*大數(shù)量及*強(qiáng)抗輻射力，事先應(yīng)驗(yàn)證所使用的劑量不影響被**物品的**性、有效性及穩(wěn)定性。常用的輻射**吸收劑量為25KGy。對(duì)*終產(chǎn)品、原料藥、某些醫(yī)療器材應(yīng)盡可能采用低輻射劑量**。**前，應(yīng)對(duì)被**物品微生物污染的數(shù)量和抗輻射強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)價(jià)**過程賦予該**物品的無菌保證水平。
**時(shí)，應(yīng)采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或物理方法對(duì)**物品吸收的輻射劑量進(jìn)行監(jiān)控，以充分證實(shí)**物品吸收的劑量是在規(guī)定的限度內(nèi)。如采用與**物品一起被輻射的放射性劑量計(jì)，劑量計(jì)要置于規(guī)定的部位。在初安裝時(shí)劑量計(jì)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)源進(jìn)行校正，并定期進(jìn)行再校正。
60Co-γ射線輻射**法常用的生物指示劑為短小芽孢桿菌孢子(Spores ofBacillus pumilus)。
四、氣體**法
本法系指用化學(xué)**劑形成的氣體殺滅微生物的方法。常用的化學(xué)**劑有環(huán)氧乙烷、氣態(tài)過氧化氫、甲醛、臭氧（O3）等，本法適用于在氣體中穩(wěn)定的物品**。采用氣體**法時(shí)，應(yīng)注意**氣體的可燃可爆性、致畸性和殘留毒性。
本法中*常用的氣體是環(huán)氧乙烷，一般與80%~90%的惰性氣體混合使用，在充有**氣體的高壓腔室內(nèi)進(jìn)行。該法可用于醫(yī)療器械，塑料制品等不能采用高溫**的物品**。含氯的物品及能吸附環(huán)氧乙烷的物品則不宜使用本法**。
采用環(huán)氧乙烷**時(shí)，**柜內(nèi)的溫度、濕度、**氣體濃度、**時(shí)間是影響**效果的重要因數(shù)?？刹捎孟铝?*條件：
溫度 （54±10）℃
相對(duì)濕度（60±10）%
**壓力 8*10〈5〉Pa
**時(shí)間 90min
**條件應(yīng)予驗(yàn)證 **時(shí)，將**腔室先抽成真空，然后通入蒸汽使腔室內(nèi)達(dá)到設(shè)定的溫濕度平衡的額定值，再通入經(jīng)過濾和預(yù)熱的環(huán)氧乙烷氣體。**過程中，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控腔室的溫度、濕度、壓力、環(huán)氧乙烷濃度及**時(shí)間。必要時(shí)使用生物指示劑監(jiān)控**效果。本法**程序的控制具有一定難度，整個(gè)**過程應(yīng)在技術(shù)熟練人員的監(jiān)督下進(jìn)行。**后，應(yīng)采取新鮮空氣置換，使殘留環(huán)氧乙烷和其他易揮發(fā)性殘留物消散。并對(duì)**物品中的環(huán)氧乙烷殘留物和反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行監(jiān)控，以證明其不超過規(guī)定的限度，避免產(chǎn)生毒性。
采用環(huán)氧乙烷**時(shí)，應(yīng)進(jìn)行泄露試驗(yàn)，以確認(rèn)**腔室的密閉性。**程序確認(rèn)時(shí)，還應(yīng)考慮物品包裝材料和**腔室中物品的排列方式對(duì)**氣體的擴(kuò)散和滲透的影響。生物指示劑一般采用枯草芽孢桿菌孢子（sporesof Bacillus subtilis)。
五、過濾**法
本法系利用**不能通過致密具空濾材的原理以除去氣體或液體中微生物的方法。常用于熱不穩(wěn)定的藥品溶液或原料的**。
**過濾器采用孔徑分布均勻的微孔濾膜作過濾材料，微孔濾膜分親水性和疏水性兩種。濾膜材質(zhì)依過濾物品的性質(zhì)及過濾目的而定。藥品生產(chǎn)中采用的**濾膜孔徑一般不超過0.22um。過濾器不得對(duì)被濾過成分有吸附作用，也不能釋放物質(zhì)，不得有纖維脫落，禁用含石棉的過濾器。濾器和濾膜在使用前應(yīng)進(jìn)行潔凈處理，并用高壓蒸汽進(jìn)行**或作在線**。更換品種和批次應(yīng)先清洗濾器，再更換濾膜。
過濾過程中無菌保證與過濾液體的初始生物負(fù)荷及過濾器的對(duì)數(shù)下降值LRV（log reduction value)有關(guān)。LRV系指規(guī)定條件下，被過濾液體過濾前的微生物數(shù)量與過濾后的微生物數(shù)量比的常用對(duì)數(shù)值。即：
LRV =lgN0-lgN
式中 N0為產(chǎn)品**前的微生物數(shù)量；
N為產(chǎn)品**后的微生物數(shù)量。
LRV用于表示過濾器的過濾**效率，對(duì)孔徑為0.22um的過濾器而言，要求每1cm2有效過濾器面積的LRV應(yīng)不小于7。因此過濾**時(shí)，被過濾產(chǎn)品總的污染量應(yīng)控制在規(guī)定的限度內(nèi)。為保證過濾**效果，可使用兩個(gè)過濾器串連過濾，或在灌裝前用過濾器進(jìn)行再次過濾。
在過濾**中，一般無法對(duì)全過程中過濾器的關(guān)鍵參數(shù)（濾膜孔徑的大小及分布，濾膜的完整性及LRV）進(jìn)行監(jiān)控。因此，在每一次過濾**前后均應(yīng)作濾器的完整性試驗(yàn)，即氣泡點(diǎn)試驗(yàn)或壓力維持試驗(yàn)或氣體擴(kuò)散流量試驗(yàn)，確認(rèn)濾膜在**過濾過程中的有效性和完整性。**過濾器的使用時(shí)間應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，一般不應(yīng)超過一個(gè)工作日，否則應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。
過濾**法常用的生物指示劑為缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta)。
通過過濾**法達(dá)到無菌產(chǎn)品應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，建議在無菌環(huán)境下進(jìn)行過濾操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其他物品應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行**，并防止再污染。
六、無菌生產(chǎn)工藝
無菌生產(chǎn)工藝系指必須在無菌控制條件下生產(chǎn)無菌制劑的方法，無菌分裝及無菌凍干是*常見的無菌生產(chǎn)工藝。后者在工藝過程中須采用過濾**法。
無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控其生產(chǎn)環(huán)境的潔凈度，并應(yīng)在無菌控制的環(huán)境下進(jìn)行過濾操作。相關(guān)的設(shè)備、包裝容器、塞子及其他物品應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行**，并防止被再次污染。
無菌生產(chǎn)工藝過程的無菌保證應(yīng)通過培養(yǎng)基無菌灌裝模擬試驗(yàn)驗(yàn)證。在生產(chǎn)過程中，應(yīng)嚴(yán)密監(jiān)控生產(chǎn)環(huán)境的無菌空氣質(zhì)量、操作人員的素質(zhì)、各物品的無菌性。
無菌生產(chǎn)工藝應(yīng)定期進(jìn)行驗(yàn)證，包括對(duì)環(huán)境空氣過濾系統(tǒng)有效性驗(yàn)證及培養(yǎng)基模擬灌裝試驗(yàn)。
生物指示劑
生物指示劑系一類特殊的活微生物制品，可用于確認(rèn)**設(shè)備的性能、**程序的驗(yàn)證、生產(chǎn)過程**效果的監(jiān)控等。用于**驗(yàn)證中的生物指示劑一般是**的孢子。
1.制備生物指示劑用微生物的基本要求
不同的**方法使用不同的生物指示劑，制備生物指示劑所選用的微生物必須具備以下特性：
（1）菌種的耐受性應(yīng)大于需**產(chǎn)品中所有可能污染菌的耐受性。
（2）菌種應(yīng)無致病性。
（3）菌珠應(yīng)穩(wěn)定。存活期長(zhǎng)，易于保存。
（4）易于培養(yǎng)。若使用休眠孢子，生物指示劑中休眠孢子含量要在90%以上。
2.生物指示劑的制備
生物指示劑的制備應(yīng)按一定的程序進(jìn)行，制備前，需先確定所用微生物的特性，如D值（微生物的耐熱參數(shù)，系指一定溫度下，將微生物殺滅90%所需的時(shí)間，以分表示）等。菌珠應(yīng)用適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)物應(yīng)制成懸浮液，其中孢子的數(shù)量應(yīng)占優(yōu)勢(shì)，孢子應(yīng)懸浮于無營(yíng)養(yǎng)的液體中保存。
生物指示劑中包含一定數(shù)量的一種或多種孢子，可制成多種形式。通常是將一定數(shù)量的孢子附著在惰性的載體上，如濾紙條、玻片、不銹鋼、塑料制品等；孢子懸浮液也可密封于安培中；有的生物指示劑還配有培養(yǎng)基系統(tǒng)。生物指示劑應(yīng)選用合適的材料包裝，并設(shè)定有效期。載體和 包裝材料在保護(hù)生物指示劑 不致污染的同時(shí)，還應(yīng)保證**劑穿透并能與生物指示劑充分接觸。載體和包裝的設(shè)計(jì)原則是便于貯存、運(yùn)輸、取樣、轉(zhuǎn)移接種。
有些生物指示劑可直接將孢子接種至液體** 物或具有與其相似的物理和化學(xué)特性的替代品中。使用替代品時(shí)，應(yīng)用數(shù)據(jù)證明二者的等效性。
3.生物指示劑的應(yīng)用
在**程序的驗(yàn)證中，盡管可通過**過程 某些參數(shù)的監(jiān)控來評(píng)估**效果，但生物指示劑的被殺滅程度，則是評(píng)價(jià)一個(gè)**程序有效性*直觀的指標(biāo)。可使用市售的標(biāo)準(zhǔn)生物指示劑，也可使用由日常生產(chǎn)污染菌監(jiān)控中分離的耐受性*強(qiáng)的微生物制備的孢子。在生物指示劑驗(yàn)證試驗(yàn)中，需確定孢子在實(shí)際**條件下的耐受性，并測(cè)定孢子的純度和數(shù)量。驗(yàn)證時(shí)，生物指示劑的微生物用量應(yīng)比日常檢出的微生物污染量大，耐受性強(qiáng)，以保證**程序有更大的**性。在*終**法中，生物指示劑應(yīng)放在**柜的不同部位。并避免指示劑直接接觸到被**物品。生物指示劑按設(shè)定的條件**后取出，分別置培養(yǎng)基中培養(yǎng)，確定生物指示劑中的孢子是否被完全殺滅。
過度殺滅產(chǎn)品**驗(yàn)證一般不考慮微生物污染水平，可采用市售的生物指示劑。對(duì)**手段耐受性差的產(chǎn)品，設(shè)計(jì)**程序時(shí)，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)計(jì)在該生產(chǎn)工藝中產(chǎn)品微生物污染的水平，選擇生物指示劑的菌種和孢子數(shù)量。這類產(chǎn)品的無菌保證應(yīng)通過監(jiān)控每批**前的微生物污染的數(shù)量、耐受性和**程序驗(yàn)證 所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估。
4.常用生物指示劑
（1）濕熱**法 濕熱**法*常用的生物指示劑 為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子 （Spores of Bacillus stearothermophilus,如NCTC 10 007、NCIMB8157、ATCC7953）。D值為 1.5~3.0min,每片（或每瓶）活孢子數(shù)5*10〈5〉~5*10〈6〉個(gè)，在121℃、19min下應(yīng)被完全殺滅。此外，還可使用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridiumsporogenes,如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955），D值為0.4~0.8min。
（2）干熱** 法 干熱**法*常用的生物指示劑 為枯草芽孢桿菌孢子（ Spores ofBacillus subtilis ,如NCIMB8058、ATCC 9372）。D值大于1.5min，每片活孢子數(shù)5*10〈5〉~5*10〈6〉個(gè)。去熱原驗(yàn)證時(shí)使用大腸埃希菌內(nèi)**（Escherichia coli endoxin），加量不小于1000**內(nèi)**單位。
（3）輻射 **法 輻射**法*常用的生物指示 劑為短小芽孢桿菌孢子（ Sporesof Bacillus pumilus ,如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142）。每片活孢子數(shù)10〈7〉~10〈8〉，置于放射劑量25KGy條件下，D值約3KGy。但應(yīng)注意**產(chǎn)品中所負(fù)載的微生物可能比短下芽孢桿菌孢子顯示更強(qiáng)的抗輻射力。因此短小芽孢桿菌孢子可用于監(jiān)控**過程，但不能用于**輻射劑量建立的依據(jù)。
（4）氣體**法 環(huán)氧乙烷***常用的生物指示菌為枯草芽孢桿菌孢 子（Spores of Bacillussubtilis,如NCTC10073、ATCC9372）。氣態(tài)過氧化氫***常用 的生物指示劑 為嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子（Sporesof Bacillus stearothermophilus,如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953）。每片活孢子數(shù)1*10〈5〉~5*10〈6〉個(gè)。環(huán)氧乙烷**中，枯草芽孢桿菌孢子D值大于2.5min，在環(huán)氧乙烷濃度為600mg/L，相對(duì)濕
度為60%，溫度為54℃下**，60min應(yīng)被殺滅 。
（5）過濾**法 過濾**法*常用的生物指示 劑為缺陷假單胞菌（Pseudomonas diminuta ,如ATCC19 146），用于濾膜孔徑為0.22um的濾器；黏質(zhì)沙雷菌（Serratin marcescens）（ATCC 14756）用于濾膜孔徑為0.45um的濾器。
